Biomaterials具有起搏功能

三维生物工程培养系统作用强大，可以快速扩展我们对人类生物学的了解并识别新的疾病治疗靶点。生物工程骨骼肌最近被证明能够概括天然肌肉生物学的许多特征。但当前的骨骼肌生物工程方法需要投入大量的细胞、试剂和人力，从而限制了它们在高通量研究中的潜力。来自昆士兰大学的JamesE.Hudson教授团队使用小型化的96孔微肌肉平台，以促进半自动组织的形成，培养并分析人体骨骼微肌肉（hμMs）。利用迭代筛选方法，定义了一种无血清的分化方案，该方案可促进人成肌细胞向骨骼肌纤维的快速定向分化。产生的hμMs包含有条纹的和功能性肌纤维的组织束，并能对电刺激做出适当反应。此外，还开发了一种光遗传学方法来长期刺激hμM，以概括运动训练的已知特征，包括肌纤维肥大和代谢蛋白表达增加。综上，该小型化方法提供了一个新的平台，可以对人体骨骼肌生物学和运动生理学进行高通量研究。

首先，将人成肌细胞接种在Ⅰ型胶原蛋白（3.3mg/ml），基质胶（22％（v/v））和DMEM培养基中。微肌肉平台的椭圆形几何设计使得32,个成肌细胞在2天内自动聚集在两个弹性柱周围（图1A和B）。细胞聚集后，将生长培养基替换为分化培养基，以促进成肌细胞融合并分化为肌纤维（图1B）。但传统的基于马血清（HS）的分化方法无法在5天内产生大量的成肌细胞融合和肌纤维形成（图1C）。因此，采用了迭代筛选方法来鉴定促进快速定向肌纤维形成的培养基条件。基于骨骼肌标志物肌间线蛋白和肌联蛋白（分别代表早期和晚期分化标志物）的表达，研究了多种因素的作用，包括基础培养基，补充剂，小分子和血清浓度在驱动肌肉分化中的作用（图1D）。首先研究了最佳的基础培养基和培养基补充剂，发现使用补充0.5％胰岛素转铁蛋白硒（ITS）和2％B-27的αMEM培养基是有利的（图1E和F）。随后，使用小分子研究了参与成肌细胞增殖和分化的细胞信号通路的功能，包括Wnt，Notch和Raf通路。CHIR是有效的GSK3抑制剂和Wnt信号激活剂，对成肌细胞的分化是有害的，与对照相比，肌间线蛋白和肌联蛋白的表达降低了约60％。（图1G）。DAPT（一种阻断Notch途径的γ分泌酶抑制剂）和达拉菲尼（一种有效的Raf抑制剂以及细胞周期的关键调节剂）都导致了肌联蛋白的表达增加（图1G和H）。使用这两种分子的所有组合均导致肌纤维的融合和形成显著增加（图1H和I），使用10μMDAPT和1μM达拉非尼分别使肌间线蛋白和肌联蛋白的表达增加2倍和4倍（图1H和I）。进一步测试了这种分子组合，发现在7天的分化期间最有效（图1J）。此外，与含有5％马血清的培养基相比，去除马血清不会对分化产生不利影响，并且确实增加了肌联蛋白的相对表达（图1K）。因此，通过迭代筛选，确定了一种快速，直接，无血清的方案，可从人成肌细胞生成hμM。该方案被称为“D＆D”，随后对其进行表型表征。

图1.在微肌肉培养平台上进行迭代筛选可确定无血清的肌肉分化方案

接下来，表征了通过标准2％HS和D＆D优化分化产生的hμM的结构，功能和基因表达（图2A）。D＆DhμM具有更丰富（图2B）和发达的肌纤维。D＆DhμM肌纤维在整个组织中均有清晰的肌间线蛋白和肌联蛋白条纹（图2C）。透射电镜证实D＆DhuMs的肌原纤维排列成交替的A带和I带，电子致密的Z线和独特的M线和H区（图2D）。表明在D＆DhuMs中具有成熟的肌节结构。此外，还发现了肌质网和T管之间的连接结构，包括三联体，反映了天然骨骼肌纤维形成（图2D）。与其他生物工程骨骼肌系统一致，hμMs表现出抽搐和强直性收缩以及对电刺激的正向力频率关系（图2E）。用D＆D分化的hμMs中的主动力（图2F）和比力（图2G）始终高于2％HS组。与成肌细胞分化为功能性肌管一致，成肌细胞标志物PAX7迅速减少（图2I），成肌细胞标志物MYH2和MYH3增加（图2J和K），钙处理基因SERCA1和RYR1增加（图2L，M）。这表明这两种情况都能够诱导骨骼肌成肌细胞分化为肌管，但优化的D＆D方案可加快分化速度并改善功能。

图2.人体骨骼微肌肉在D＆D与2％HS中分化的比较

胎儿肌球蛋白重链亚型在包括MYH3和MYH8在内的分化过程中迅速增加，并且在第3天与第7天的丰度相似。然而，许多成人肌球蛋白重链亚型（MYH1，MYH2和MYH7）在任何时间点均未受到严格调节。其他的肌节蛋白，例如TTN和钙处理基因（CASQ2，CASQ1，ATP2A1或SERCA1，ATP2A2或SERCA2和RYR1）在hμM分化过程中迅速增加（图3A）。以及使用D＆D进行快速，定向的分化过程。第7天与第0天的蛋白质丰度分析表明，在D＆D诱导的分化过程中，超过种蛋白质显着上调或下调。（图3B）。其中一些蛋白质在7天的实验过程中逐渐增加，并且主要成分分析显示，在每个时间点hμMs聚集以有序方式进行分化（图3C）。每个时间点的样本都有明显的聚集，显著调节的蛋白质的分层聚集支持了这一发展进程。（图3D）。表明D＆D诱导迅速分化为骨骼肌表型，并且代谢过程随时间逐渐成熟。

图3.对人体骨骼微肌肉发育的蛋白质组学分析揭示了使用D＆D的快速分化反应

然后，比较了成人骨骼肌组织（hSkM组织）和通过D＆D分化7天获得的hμMs之间的蛋白质表达。尽管与hSkM组织相比，hμM中的蛋白质丰度之间存在显著关系（图4A），但皮尔逊相关系数为0.57，说明也存在一定的差异。这些差异包括胎儿肌球蛋白重链亚型的较高表达，成人肌球蛋白重链亚型的较低表达和某些钙处理基因的较低表达（图4B）。对hSkM组织中与hμMs相比丰度更高的前50种蛋白质的GO分析表明，大多数生物过程都富含新陈代谢和能量产生（图4C）。总之，这表明即使D＆D在第7天诱导hμMs迅速分化并诱导代谢过程，代谢蛋白的表达仍低于hSkM组织。

图4.第7天的hμMs与成年人类骨骼肌的蛋白质组学比较

为了刺激hμMs，开发了一种光遗传学方法来实现hμMs的体外慢性收缩（图5A）。用腺病毒处理hμMs，以允许控制hμM收缩，以及提供光学方法以可视化细胞去极化（图5B）。为了刺激收缩，将hμMs每5s（0.2Hz）暴露于ms的单个光脉冲中，每天2h。每次光脉冲后，都会引起一次强直性收缩（图5C）。刺激（STIM）4天后，总共收缩次，与时间匹配的未刺激对照组织相比，主动力或强直抽搐率没有明显变化（图5D和E）。然而，与第1周的组织相比，强直抽搐的比率有所增加（图2E），其水平接近成年骨骼肌，表明延长培养时间会导致功能改善（图5E）。慢性刺激增加了hμM的投射面积（图5F），肌管纤维直径（图5G）和肌动蛋白强度（图5H和I），这与天然肌肉在抵抗运动中的变化一致。蛋白质组学分析揭示了种蛋白质的差异表达，其变化与线粒体的生物，组织，能量产生和细胞呼吸有关（图5J）。这些结果表明光遗传学刺激可用于使生物工程化的骨骼肌成熟，并且该模型能够概括出运动适应的一些体内特征。

图5.光遗传刺激可以诱导成熟的某些方面，并概括运动的某些特征

综上所述，对成肌细胞扩增方案的研究和人类多能干细胞成肌细胞分化方案的发展对于促进大规模hμM研究至关重要。该研究提供了概念验证，可以在生物工程骨骼肌中进行高通量研究，从而可以对人类肌肉生理学、病理生理学和运动适应性进行未来的高通量研究。

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